人宮頸癌蛋白（hHCCR-1）ELISA 檢測試劑盒

                                              Cat.No：PY-30001

1 試劑盒組分

注：2-8 ℃保存。

2需自備的試劑和耗材

3 檢測原理

 該試劑盒基于夾心ELISA 檢測原理，包含針對目的蛋白的捕獲抗體和檢測抗體，用于檢測樣品中的hHCCR-1。

1. 用1x 捕獲抗體包被ELISA 板。
2. 用5% 的脫脂乳封閉。
3. 檢測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的孵育。
4. 用HRP 標(biāo)記的IgY檢測hHCCR-1。
5. TMB 顯色。

1. 試劑的準(zhǔn)備

  注：按以下步驟準(zhǔn)備工作液。所有準(zhǔn)備的試劑應(yīng)充分混勻并在用前置于室溫預(yù)熱。

1）1X 稀釋緩沖液：用前用雙蒸水稀釋10X 的緩沖液到1X。

2）1X捕獲抗體IgY：用1X 稀釋緩沖液稀釋20X IgY捕獲抗體。

3) ELISA 96孔板：

  選擇需要的孔數(shù)，剩余的孔放入置干燥劑的密封袋中，袋需要重新密封，避免受潮。

1. 血液的收集和儲存

1 ）  制備血清樣品。

• 全血樣品置于離心管中（不含抗凝劑），置于室溫30min
• 4℃ 2000-3000g ，離心15 min。
• 用新鮮的血清樣品或分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。長期儲存保存于-70℃。避免反復(fù)凍融。
  1. ）制備血漿樣品。

用離心管收集全血樣品到離心管（含終濃度1.735mg/ml K₃EDTA抗凝劑），收集后立即離心。

1. ）如果用肝素抗凝，肝素的用量對實驗結(jié)果的影響，需提前測定。
2. ）避免使用溶血樣品或脂血樣品。

1. 樣品的準(zhǔn)備

用70ul 1x 稀釋緩沖液稀釋35ul血清樣品。（推薦使用新鮮的血清樣品）。

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

用前，等體積輕柔混合2X 稀釋緩沖液和重組蛋白（1.024mg/ml）5分鐘，避免出現(xiàn)氣泡，直到蛋白溶解。混合液（0.512mg/ml）穩(wěn)定性不超過1天。

標(biāo)準(zhǔn)品需用1x 稀釋緩沖液，2倍系列稀釋，起始濃度256 ng/ml 。每孔100ul。

1. 檢測抗體（HRP標(biāo)記）的稀釋

用5% 脫脂乳1：500 稀釋檢測抗體，每孔100ul。

1. 底物稀釋液

用前1:1 混合顯色液A 和顯色液B。每孔加入100ul，混合液穩(wěn)定性不超過1天。

1. 操作程序

A 標(biāo)準(zhǔn)品、檢測樣品和對照的操作程序

1. 每孔加入100ul 1x IgY捕獲抗體。輕輕封板，25℃孵育4小時。
2. 用400ul，1X PBST 洗板一次。
3. 每孔加入200ul 5% 脫脂乳。輕輕封板，25℃孵育1小時。
4. 用400ul，1X PBST 洗板一次。
5. 每孔加入檢測的血清樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照（1x 稀釋緩沖液）100ul到對應(yīng)孔中，做復(fù)孔。
6. 輕輕封板，4℃孵育Overnigt。

   B 檢測抗體的應(yīng)用

 1）用400ul，1X PBST 洗板一次。

 2) 每孔加入100ul 稀釋后的（1：500）IgY 抗體。

 3）輕輕封板，25℃孵育1小時。

C 底物反應(yīng)液

  1）用400ul 1X PBST 洗板3次。

  2）每孔加入100ul 底物混合液。

  3) 室溫孵育5-20 分鐘，每孔加入100ul 終止液。

  4）20min內(nèi)讀取450nm OD值。

  D  結(jié)果

  標(biāo)準(zhǔn)曲線用于確定檢測未知樣品中目的蛋白的含量。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(X軸)和對應(yīng)的OD（Y軸），做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

  1）計算每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均OD值。分析結(jié)果前，所有的OD需減去陰性對照（0ng/ml:空白孔）的OD 值。用OD做縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品做橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2）為了計算每個樣品中目的蛋白的含量，需讀取檢測樣品的OD值，找到對應(yīng)的X軸樣品濃度值，讀取樣品濃度。如果檢測到的樣品濃度，高于zui高樣品濃度，重新稀釋樣品，重新做。zui后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取的樣品濃度 乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品實際濃度。

    3）樣品實際濃度為標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取的樣品濃度 乘以樣品稀釋倍數(shù)，此試劑盒的樣品稀釋倍數(shù)為3。

   標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖

 注：此說明書，僅供參考，以英文說明書為準(zhǔn)