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小鼠IgE抗體檢測試劑盒Mouse Total IgE Kit
發(fā)布時間：2021/3/9
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小鼠總IgE抗體檢測試劑盒
Mouse Total IgE (IgEa and IgEb) Detection ELISA Kit
Ca#3005
背景簡介：
Ⅰ型超敏反應是一種典型的過敏性疾病，如哮喘、濕疹、花粉熱、蕁麻疹等。這種超敏反應是由IgE抗體介導的。IgE抗體與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的高親和力IgE受體（FcεRI）結合，并通過FcεRI（1）的穩(wěn)定和積累顯著上調(diào)FcεRI的表達，增強對過敏原的超敏反應。與細胞表面IgE抗體結合的特異性變應原交聯(lián)FcεRI（2-3），引起肥大細胞的刺激和脫顆粒。這與多種促炎介質(zhì)和細胞因子的釋放有關，如組胺、蛋白水解酶、肝素和趨化因子，這些都會導致與I型超敏反應相關的癥狀。在過敏性疾病和寄生蟲感染的疾病中，血清IgE抗體水平通常會升高。盡快血清IgE水平不能單獨反應患者的過敏狀態(tài)和臨床癥狀，但是很明顯血清IgE水平升高有助于診斷人類的這些疾病。
試劑盒組分：
組分 | 數(shù)量 | 規(guī)格 | 保存溫度 |
IgE標準品（30051） | 1 | 100ng/瓶，凍干粉 | -20℃ |
捕獲抗體（30052） | 1 | 0.1ml | -20℃ |
檢測抗體（30053） | 1 | 凍干粉 | -20℃ |
溶液A-包被緩沖液（30054） | 1 | 10ml | -20℃ |
溶液B-樣本、標準品緩沖液（30055） | 1 | 50ml | -20℃ |
溶液C-檢測抗體緩沖液（30056） | 1 | 10ml | -20℃ |
溶液D-鏈親和素-HRP緩沖液（9055） | 1 | 20ml | -20℃ |
鏈親和素-HRP(9029) | 2 | 50ul/管 | -20℃ |
TMB 顯色液（90023） | 2 | 0.2ml | -20℃ |
顯色液稀釋液（90022） | 1 | 10ml | -20℃ |
洗液，20X(9005) | 1 | 50ml | -20℃ |
ELISA 板 | 1 | 96孔（8x12） | -20℃ |
檢測流程：
1)加入100ul 稀釋后的捕獲抗體到各孔。
2）4℃孵育過夜，洗板。
3）加入100ul稀釋后的標準品和樣本。
4）室溫孵育2小時，洗板。
5）加入100ul稀釋后的檢測抗體。
6）室溫孵育1小時，洗板。
7）加入100ul吸收后的鏈親和素-HRP。
8）室溫孵育1小時，洗板。
9）加入100ul TMB顯色液
10）室溫孵育25min
11)加入50ul終止液
12）讀取450nm/630nm吸光度值
注意事項：
- 建議樣本、標準品均做復孔檢測
- 用前所有的緩沖液置于室溫平衡
- 20X洗滌液低溫可能會有結晶析出。如果有結晶析出，把洗滌液瓶置于溫水中直至結晶*溶解。
- 用移液器準確定量提供的緩沖液，提供額外的緩沖液。
- 每個步驟結束后，用封板膜封板，防止蒸發(fā)。
- 如果只是用部分試劑，請參照操作步驟中的用量，做相應的使用量緩沖液配制。未使用的儲液在原包裝管內(nèi)保存，置于-20℃保存。
- 正常小鼠總IgE水平大概在50-100ng/ml,氫氧化鋁佐劑免疫2周后，抗體水平提高到ug/ml。隨后用抗原免疫后增加至10-20ug/ml。
操作流程：
1.加入包被抗體：用10ml包被抗體稀釋液（Solution A）稀釋1管包被抗體?；蛘吒鶕?jù)用量按下表稀釋。加入100ul稀釋后的包被抗體液到各孔，4℃過夜孵育。剩余包被抗體儲液-20℃凍存用于后續(xù)實驗。
板條數(shù) | 包被抗體 | 溶液A(ml) |
2 | 17 | 1.7 |
4 | 33 | 3.3 |
6 | 50 | 5.0 |
8 | 66 | 6.6 |
10 | 82 | 8.2 |
12 | 100 | 10.0 |
2.制備標準品稀釋液：推薦的標準品范圍是1.6-100ng/ml。用樣本/標準品稀釋液（Solution）1ml稀釋1管標準品（100ng/管），制備100ng/mlIgE標準品儲液，隨后用稀釋液做系列稀釋，制備：100ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.3ng/ml, 3.1ng/ml, 1.6ng/ml。剩余的標準品儲液（100ng/ml）可以-20℃保存，用于后續(xù)實驗。建議您每次實驗室，制備新鮮標準品。
3.制備稀釋樣本：正常血清推薦稀釋比是1:10-1:50。免疫過的小鼠血清稀釋比從：1:100~1:1000，具體取決于免疫程序和血清樣本收集時間。
4.洗滌緩沖液稀釋：用950ml雙蒸水（1x洗液）稀釋50ml 20x洗液。用1x稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。
5.加入標準品和樣本：加入100ul標準品，SolutionB(空白)和樣本到對應孔（做復孔。）室溫孵育2小時。
6.洗滌：用1x稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。
7.加入檢測抗體：用10ml檢測抗體稀釋液（SolutionC）稀釋1管檢測抗體?；蛘哂?span>50ul SolutionC稀釋1管檢測抗體，按表格里需求量稀釋。加入100ul抗體抗體稀釋液到各孔，室溫孵育1小時.
板條數(shù) | 檢測抗體（ul） | 溶液C(ml) |
2 | 8 | 1.7 |
4 | 17 | 3.3 |
6 | 25 | 5.0 |
8 | 33 | 6.6 |
10 | 42 | 8.2 |
12 | 50 | 10.0 |
8.洗滌：用1X稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。
9.加入鏈霉親和素-HRP:用10ml鏈霉親和素稀釋液(Solution D)稀釋1管鏈霉親和素-HRP。加入100ul稀釋后的鏈霉親和素稀釋液到各孔，室溫孵育1小時。
板條數(shù) | 檢測抗體（ul） | 溶液C(ml) |
2 | 8 | 1.7 |
4 | 17 | 3.3 |
6 | 25 | 5.0 |
8 | 33 | 6.6 |
10 | 42 | 8.2 |
12 | 50 | 10.0 |
10.洗滌：用1X稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。
11.加入TMB:用新管制備TMB。用前10ml底物稀釋液一管TMB。加入100ulTMB稀釋液到各孔，室溫孵育25min。
板條數(shù) | TMB（ul） | 底物稀釋液(ml) |
2 | 34 | 1.7 |
4 | 66 | 3.3 |
6 | 100 | 5.0 |
8 | 132 | 6.6 |
10 | 164 | 8.2 |
12 | 200 | 10.0 |
12.終止：加入50ul 2N硫酸（終止液）到各孔。
13.讀板：讀取450nm OD值。如果樣本OD值大于標準品高OD值，樣本稀釋后重新檢測。630nm波長，檢測的副波長。
結果計算：
1.計算空白孔、樣本和標準品OD值的平均值。
2.用標準品和樣本OD均值減去空白孔OD值。
3.用標準OD值和標準品濃度值，繪制標準曲線。用Log/Log擬合曲線。見圖例1.
4.通過回歸曲線計算樣本中濃度值，通過乘稀釋倍數(shù)得到樣本的原始濃度值
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