佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（AIA）

背景介紹

1956年，Pearson 發(fā)現(xiàn)用*佐劑免疫大鼠可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。這種關(guān)節(jié)炎模型，被稱為佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，被廣泛用作關(guān)節(jié)炎研究的動(dòng)物模型。AIA 也可用其他的其他細(xì)菌誘導(dǎo)：比如丁酸、表皮葡萄球菌等。Kohashi等研究發(fā)現(xiàn)：肽聚糖是這些細(xì)菌細(xì)胞壁中共同的致病因素，肽聚糖衍生物MDP中具有較低的致病性。

通過引入關(guān)節(jié)炎大鼠的T細(xì)胞（不是血清抗體）可以再正常的大鼠誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎性T細(xì)胞識(shí)別結(jié)合菌65kDa熱休克蛋白的抗原表位（180-188殘基），這個(gè)表位結(jié)構(gòu)與結(jié)蹄組織中蛋白聚糖連接態(tài)的結(jié)構(gòu)相同。這表明，T細(xì)胞對(duì)自體成分有免疫應(yīng)答，有助于誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。

備注：

以前，AIA被用作關(guān)節(jié)炎研究的動(dòng)物模型，但這種關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎而不是真正的關(guān)節(jié)炎。研究表明：AIA動(dòng)物模型與真正的關(guān)節(jié)炎在組織學(xué)和免疫學(xué)特征上是有區(qū)別的。AIA模型用于外部因素激發(fā)的導(dǎo)致的自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商

即使是同一品系，不同供應(yīng)商提供的大鼠在遺傳背景上和菌群上也不同。這種差異導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果上的差異。Chondrex 推薦客戶在批量實(shí)驗(yàn)前，先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，比較不同供應(yīng)商實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的差異。

室內(nèi)條件

環(huán)境因素的影響對(duì)于AIA模型也非常重要。比如：無菌的Fisher 344(F344)大鼠對(duì)AIA非常易感，SPF動(dòng)物條件和常規(guī)的動(dòng)物條件， 會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。傳統(tǒng)的動(dòng)物條件也會(huì)誘發(fā)F344大鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎，但是嚴(yán)重程度和發(fā)病率要相對(duì)低于20%。

大鼠品系和日齡

Lewis、SD、Wister 及BN大鼠被認(rèn)為是AIA誘導(dǎo)的易感品系。 BUF、F344及糖尿病大鼠是中度和輕度的易感品系。易感性因動(dòng)物供應(yīng)商、免疫劑量及分枝桿菌的來源和制備方法的不同而不同。推薦6-12周齡的大鼠用于誘導(dǎo)AIA模型。大鼠幼鼠（1-7日齡）不易感，而老齡鼠（≥9個(gè)月）相對(duì)抗性太強(qiáng)。

注：Dark agouti(DA)大鼠對(duì)AIA（*佐劑誘導(dǎo)），CIA（膠原誘導(dǎo)）,OIA(不*佐劑誘導(dǎo))的關(guān)節(jié)炎都非常易感。這個(gè)品系的關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制與其他品牌誘導(dǎo)的AIA模型可能是不同的。因此，如果用DA大鼠誘導(dǎo)AIA模型做研究比較復(fù)雜，需要考慮更多的影響因素。

           常用的誘導(dǎo)AIA動(dòng)物模型的品系

佐劑

A.油劑類型

礦物油的來源也是影響AIA造模的關(guān)鍵因素。弗氏不*佐劑（cat7002#）常被用于相應(yīng)的油劑，但是可用于生物降解的植物油，例如：橄欖油也可以用作佐劑。有報(bào)道表明用海鮫油劑誘導(dǎo)低敏感性的F344大鼠非常有效。但在實(shí)際應(yīng)用中，礦物油，海鮫油，液體石蠟對(duì)于誘導(dǎo)易感品系的大鼠具有相同的效果。

B.結(jié)核桿菌

不同來源的分枝桿菌分離出的肽聚糖、胞壁酰二肽（MDP），都被用作抗原誘導(dǎo)AIA.。滅活的分枝桿菌顆粒大小是影響AIA造模的重要因素。小的顆粒相比大顆粒或聚合物具有更好的免疫原性。為了有效誘導(dǎo)AIA模型，推薦結(jié)核桿菌濃度至少5mg/ml。 10mg/ml(cat#7027)被廣泛應(yīng)用于AIA模型誘導(dǎo)。

注：1mg/ml 的*佐劑，由于結(jié)核桿菌濃度太低，很難有效誘發(fā)AIA模型。

免疫方法

通過單次尾根部皮下注射，對(duì)易感品系很容易誘發(fā)AIA動(dòng)物模型，對(duì)于一些不敏感的品系，佐劑需要進(jìn)入淋巴系統(tǒng)才能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究表明，對(duì)于F344這種不敏感的品系，淋巴系統(tǒng)免疫佐劑比常規(guī)足墊免疫誘發(fā)AIA更有效。

每次免疫前都需要重懸佐劑，保證結(jié)核桿菌混勻，如果沒有重懸，佐劑中的結(jié)核桿菌分布不均勻。

注：乳化佐劑

AIA模型不需要對(duì)佐劑進(jìn)行乳化。但是為了避免出現(xiàn)結(jié)核桿菌分布不均勻的問題，*佐劑常與生理鹽水或緩沖液等體積制備乳劑用于誘導(dǎo)AIA。有報(bào)道用*佐劑與肽聚糖或MDP混合制備乳劑誘導(dǎo)F344大鼠的AIA模型。關(guān)于乳劑的制備方法，請(qǐng)參考A部分“乳劑制備操作流程”

佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎操作流程（AIA）

A.佐劑制備

Chondrex公司提供10mg/ml （cat#7027）和20mg/ml(cat#7024)，在注射之前混勻佐劑，確保結(jié)核桿菌均勻分布。

B．注射

選擇足底免疫還是尾根部免疫取決于具體的研究目的。

1.足底免疫

后爪足墊皮下免疫0.05ml *佐劑(cat#7027 10 mg/ml)。針頭應(yīng)插入足墊皮下指向腳踝方向：這樣能夠保證佐劑引流到淋巴結(jié)。30min內(nèi)會(huì)看到嚴(yán)重的急性炎癥反應(yīng)，高峰期3-4天，通常情況下回持續(xù)20-25天。免疫的后爪不能作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)榧词蛊渌闹紱]有腫脹，免疫的后爪也會(huì)發(fā)生腫脹。

免疫后12-14天在未注射的爪子發(fā)生腫脹，高峰期2-3天，關(guān)節(jié)炎會(huì)持續(xù)20-25天。但是有一些大鼠會(huì)反生由骨膜反應(yīng)引起的慢性骨性肥大。

2.尾根部免疫

尾根部皮下免疫0.05ml *佐劑(cat#7027 10 mg/ml)。這種方法的有點(diǎn)是能夠使4只爪子都發(fā)生腫脹。免疫后12-14天在爪子發(fā)生腫脹，關(guān)節(jié)炎會(huì)持續(xù)20-25天。

注：如果用（cat#7024 20 mg/ml）佐劑免疫，注射體積應(yīng)降低一半。

            圖1.尾根部皮下免疫

C．關(guān)節(jié)炎評(píng)估

1）評(píng)分：

關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度可以通過外觀評(píng)分。10-25天，通過日常觀察，評(píng)估疾病的發(fā)展進(jìn)程。如果采取尾根部免疫，四肢都要做評(píng)分（0-4分）：0分：正常 1分：中度關(guān)節(jié)炎 4分：嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。尾根部免疫關(guān)節(jié)炎評(píng)分高分為16分（4只爪總分），如果采取足墊免疫評(píng)分高為12分（免疫的爪不做評(píng)分）。除每日評(píng)分外，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，記錄每個(gè)爪的評(píng)分。后者反應(yīng)了關(guān)節(jié)炎的炎癥的加重程度，特別是前后爪發(fā)病不同步的時(shí)候。

2）足趾厚度和體積評(píng)估

足趾腫脹也可以通過測(cè)定足趾厚度和體積進(jìn)行評(píng)估，可以采用足趾測(cè)量?jī)x或體積測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定評(píng)估。

3）局部熱療評(píng)估

局部熱療評(píng)估是是非常準(zhǔn)確的檢測(cè)炎癥程度的指標(biāo)，這種方法操作簡(jiǎn)單且非常靈敏?？梢杂茫航佑|式溫度計(jì)測(cè)量爪子表面溫度。

                         圖2.AIA模型的抗炎癥藥物評(píng)估

用0.05ml 10mg/ml的佐劑誘導(dǎo)的SD大鼠的AIA模型。0-20天每天口服抗炎癥藥物（E-5110: 3 mg/kg)。通過測(cè)定1-20天，后爪（左）的炎癥和14-20后爪（右）炎癥反應(yīng)評(píng)估藥物效果。紅色：對(duì)照大鼠 紫色：藥物處理的大鼠。

參考文獻(xiàn)

1. C. Pearson. Development of arthritis, periarthritis and periotitis in rats given adjuvant. Proc Soc Exp Biol Med 1956;91:95-101.

2. Kobashi O, Pearson CM, Beck FW, Narita T, Kotani S.Arthritogenecity in rats of cell walls from several Streptococci,Staphylococci and two other bacteria. Proc Soc Exp Biol Med 1976;152:156-60.

3. Best R, Christian R, Lewis DA. Effect of particle size of dried mycobacteria on adjuvant induced arthritis in the rat. In?ammation Res 1984;14:256-68.

4. Kohashi O, Kuwata J, Umehara K, Uemura F, Takahashi T,Ozawa A. Susceptibility to adjuvant-induced arthritis among germfree, specific-pathogen-free, and conventional rats. Infection

& Immunity 1979;26:791-4.

5. Kohashi O, Pearson CM, Watanabe Y, Kotani S, Koga T. Structural requirements for arthritogenecity of peptidoglycans from Staphylococcus aureus and Lactobacillus plantarum and

analogous synthetic compounds. J Immunol 1976;116:1635-39.

6. van Eden, W Thole JE, van der Zee R, et al. Cloning of the mycobacterial epitope recognized by T lymphocytes in adjuvant arthritis. Nature 1988;331:171-3.

7. van Eden, W Holoshitz J, Nevo Z, et al. Arthritis induced by aT-lymphocyte clone that responds to mycobacterium tuberculosis and to cartilage proteoglycans. Proc Natl Acad Sci USA

1985;82:5117-20.

8. Lorentzen JC. Identification of arthritogenic adjuvants of self and foreign origin. Scan J immunol 1999;49:45-50.

9. Kohashi O, Pearson CM, Beck FW, Alexander M. Effect of oil composition on both adjuvant-induced arthritis and delayed hypersensitivity to purified protein derivative and peptidoglycans in various rats strains. Infec Immun 1977;17:244-9.

10. Cremer MA, Towns AS, Kang AH. Adjuvant-induced arthritis in rats. Evidence that autoimmunity to homologous collagen types I, II, IX and XI is not involved in the pathogenesis of arthritis. Clin

Exp Immunol 1990;82:307-12.

11. Whitehouse MW. Adjuvant-induced polyarthritis in rats. Handbook of animal models for the rheumatic diseases. CRC Press 1988;1:3-

12. Shirota H, Kobayashi S, Shiojiri H, Igarashi T. Determination of in?amed paw surface temperature in rats. J Pharmacol Methods

1984;12:35-43.

13. Shirota H, Goto M, Katayama K. Application of adjuvant-induced local hyperthermia for evaluation of anti-in?ammatory drugs. J Pharmacol Exp Ther 1988;247:1158-63.

14. L. Bevaart, M. J. Vervoordeldonk, P. P. Tak, Evaluation of therapeutic targets in animal models of arthritis: How does it relate to rheumatoid arthritis? Arthritis & Rheumatism 2010;62:2192–2205.

15. O. Kohashi et al., Susceptibility to adjuvant-induced arthritis among germfree, specific-pathogen-free, and conventional rats. Infect. Immun 1979;26:791–794.